{"id":5663,"date":"2017-09-13T09:00:55","date_gmt":"2017-09-13T07:00:55","guid":{"rendered":"http:\/\/naukowy.blog.polityka.pl\/?p=5663"},"modified":"2017-09-13T12:35:36","modified_gmt":"2017-09-13T10:35:36","slug":"jak-ngago-nie-dalo-rady-crisprcas9","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/2017\/09\/13\/jak-ngago-nie-dalo-rady-crisprcas9\/","title":{"rendered":"Jak NgAgo nie da\u0142o rady CRISPR\/Cas9"},"content":{"rendered":"

\"\"Czytaj\u0105c numer „Nature Biotechnology” z maja 2016 roku, mo\u017cna by\u0142o dosta\u0107 niema\u0142ych wypiek\u00f3w na wie\u015b\u0107 o rewolucji w edytowaniu genomu, bij\u0105cej na g\u0142ow\u0119 s\u0142ynny ju\u017c CRISPR\/Cas9. Od tego czasu wiele si\u0119 zdarzy\u0142o…
\n
\nPrzypomnia\u0142a mi si\u0119 pewna publikacja na \u0142amach „Science” z 2011 r. Felisa Wolf-Simon i jej wsp\u00f3\u0142pracownicy opisali wtenczas<\/a> szczep bakterii wyizolowany z osad\u00f3w kalifornijskiego jeziora Mono, kt\u00f3rego wody charakteryzuje naturalnie podwy\u017cszona zawarto\u015b\u0107 zwi\u0105zk\u00f3w arsenu. Wed\u0142ug autor\u00f3w bakteria o akronimie GFAJ-1 (skr\u00f3t od „Give Felisa a Job”) w warunkach deficytu fosforu mia\u0142a posiada\u0107 zdolno\u015b\u0107 inkorporacji do DNA… toksycznych arsenian\u00f3w w miejsce grup fosforanowych.<\/p>\n

Czy\u017cby arsen m\u00f3g\u0142 by\u0107 „pierwiastkiem \u017cycia”, a gdzie\u015b w odm\u0119tach prawdopodobnie najstarszego ameryka\u0144skiego jeziora zachodzi\u0142a alternatywna \u015bcie\u017cka ewolucji? „Biosfera cieni”<\/a>? A mo\u017ce nawet, jak to rozmy\u015blnie sugerowa\u0142a NASA, po\u015bredni dow\u00f3d na istnienie… \u017cycia pozaziemskiego? Nic bardziej mylnego.<\/p>\n

Publikacja okaza\u0142a si\u0119 w najlepszym przypadku bublem pe\u0142nym b\u0142\u0119d\u00f3w metodologicznych i interpretacyjnych<\/a>, a wykonane przez inne zespo\u0142y badania<\/a> potwierdzi\u0142y to, co by\u0142o wiadomo od dawna – \u017cycie nie mo\u017ce by\u0107 oparte na arsenie. Felisie w efekcie nie zaproponowano dalszej pracy w US Geological Survey. Czasopismo „Science” do dzi\u015b jednak nie zdecydowa\u0142o si\u0119 wycofa\u0107 rzeczonej publikacji. Odmiennie post\u0105pi\u0142o „Nature Biotechnology”, kt\u00f3re w\u0142a\u015bnie wycofa\u0142o niezwykle medialny artyku\u0142<\/a> dotycz\u0105cy wspomnianego w tytule NgAgo. Dlaczego?<\/p>\n

By udzieli\u0107 odpowiedzi, trzeba cofn\u0105\u0107 si\u0119 odrobin\u0119 w czasie, a \u015bci\u015blej do 1987 r. Wtedy po raz pierwszy zaobserwowano<\/a>, \u017ce w materiale genetycznym bakterii wyst\u0119puj\u0105 intryguj\u0105ce fragmenty o charakterystycznie powtarzaj\u0105cej si\u0119 kolejno\u015bci zasad azotowych, tzw. regularnie zgrupowane, oddzielone, kr\u00f3tkie sekwencje palindromowe (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats<\/em>; CRISPR). Dopiero p\u00f3\u017aniej stwierdzono<\/a>, \u017ce sekwencje te s\u0105 rezultatem dzia\u0142ania systemu obronnego bakterii, takim prokariotycznym uk\u0142adem odporno\u015bciowym.<\/p>\n

W du\u017cym uproszczeniu: zaatakowana przez wirusa bakteria wbudowuje fragmenty jego DNA do w\u0142asnego genomu. Nowe sekwencje ulegaj\u0105 nast\u0119pnie normalnej transkrypcji, czego rezultatem s\u0105 kr\u00f3tkie cz\u0105steczki RNA, kt\u00f3re tworz\u0105 kompleksy z endonukleaz\u0105 Cas9. Gdy do wn\u0119trza bakteryjnej kom\u00f3rki ponownie wnika ten wirus, wspomniane nici RNA \u0142\u0105cz\u0105 si\u0119 z fragmentem jego DNA, kt\u00f3ry jest do nich komplementarny, a Cas9 dokonuje w tym miejscu obustronnego przeci\u0119cia nici. Dla intruza to swoisty game over.<\/p>\n

Opowie\u015b\u0107 jednak wcale si\u0119 tu nie ko\u0144czy, a dopiero na dobre zaczyna. W 2012 r. uda\u0142o si\u0119 po raz pierwszy<\/a> wykorzysta\u0107 opisane powy\u017cej zjawisko do cel\u00f3w in\u017cynierii genetycznej. Do kom\u00f3rki wprowadza si\u0119 plazmidowe DNA, kt\u00f3re posiada zdolno\u015b\u0107 ekspresji zar\u00f3wno Cas9, jak i kr\u00f3tkiego, jednoniciowego RNA (tzw. gRNA, ang. guided RNA<\/em>) o sekwencji komplementarnej z wybranym przez badacza fragmentem DNA, kt\u00f3ry ma podlega\u0107 edycji. Nast\u0119pnie gRNA \u0142\u0105czy si\u0119 z nim, a Cas9 dokonuje obustronnego ci\u0119cia. Pisz\u0105cy na blogu Karol Fiedorczuk trafnie nazwa\u0142 system CRISPR\/Cas9 mianem „no\u017cyc do DNA”<\/a>.<\/p>\n

Na ci\u0119ciu si\u0119 oczywi\u015bcie nie ko\u0144czy. Kom\u00f3rka uruchamia system naprawczy, kt\u00f3ry w obliczu obustronnego usuni\u0119cia fragmentu DNA mo\u017ce mie\u0107 problem z odtworzeniem straconych sekwencji i mo\u017ce postanowi\u0107, by po po prostu scali\u0107 ko\u0144ce nici ze sob\u0105. W ten spos\u00f3b mo\u017ce doj\u015b\u0107 do skutecznego wyciszenia ekspresji danego genu – powsta\u0142e bia\u0142ko b\u0119dzie mia\u0142o zmienion\u0105 struktur\u0119 i ca\u0142kiem mo\u017cliwe, \u017ce b\u0119dzie dysfunkcjonalne.<\/p>\n

Do kom\u00f3rki mo\u017cna te\u017c wprowadzi\u0107 du\u017c\u0105 ilo\u015b\u0107 DNA, kt\u00f3re posiada po\u017c\u0105dan\u0105 sekwencj\u0119 zasad, ograniczon\u0105 z obu stron sekwencjami homologicznymi do ko\u0144c\u00f3w przeci\u0119tej nici. Istnieje wtenczas du\u017ca szansa, \u017ce to w\u0142a\u015bnie ten fragment DNA zostanie wbudowany w wyci\u0119te miejsce w procesie zwanym \u201enapraw\u0105 sterowan\u0105 przez homologi\u0119\u201d (tzw. HDR, ang. homology driven repair<\/em>). Rachu, ciachu i genom zedytowany.<\/p>\n

Nic wi\u0119c dziwnego, \u017ce system CRISPR\/Cas9 wywo\u0142a\u0142 naukowe trz\u0119sienie ziemi. Nie do\u015b\u0107, \u017ce dawa\u0142 du\u017ce mo\u017cliwo\u015bci, to jeszcze by\u0142 prostszy w obs\u0142udze i o wiele ta\u0144szy ni\u017c inne metody, takie jak palce cynkowe (ang. zinc fingers<\/em>) czy sztucznie stworzone enzymy restrykcyjne (tzw. TALENy). W samym 2016 r. publikowano \u015brednio 20 artyku\u0142\u00f3w tygodniowo dotycz\u0105cych edycji genomu przy jego wykorzystaniu. W bazie PubMed znajdziemy ponad 5 tys. prac z ostatnich 5 lat po\u015bwi\u0119conych wykorzystaniu tej CRISPR\/Cas9 do takich cel\u00f3w jak chocia\u017cby skuteczne inaktywowanie wirusa HIV<\/a>, ograniczanie rozprzestrzeniania si\u0119 zarod\u017aca malarii<\/a>, nadawanie nowych w\u0142a\u015bciwo\u015bci ro\u015blinom uprawnym<\/a>, terapia z\u0142o\u015bliwych nowotwor\u00f3w<\/a> czy eliminacja powa\u017cnych mutacji w kom\u00f3rkach ludzkich embrion\u00f3w<\/a>.<\/p>\n

Mimo tak ogromnego potencja\u0142u i wbrew obiegowej opinii, \u017ce CRISPR\/Cas9 otwiera mo\u017cliwo\u015b\u0107 dokonywania dowolnych zmian w genomie, metoda ta ma jednak kilka istotnych ogranicze\u0144. Do najwa\u017cniejszych z nich nale\u017c\u0105:<\/p>\n

1. Przeci\u0119tna d\u0142ugo\u015b\u0107 gRNA to oko\u0142o 20 nukleotyd\u00f3w, co znacznie ogranicza mo\u017cliwo\u015bci edycji.
\n2. Sekwencje gRNA nie musz\u0105 by\u0107 w 100 proc. komplementarne do docelowego odcinka DNA. Innymi s\u0142owy, gRNA mo\u017ce z\u0142\u0105czy\u0107 si\u0119 z fragmentem DNA r\u00f3wnie\u017c wtedy, gdy pasuje do niego np. 18 na 20 nukleotyd\u00f3w. Rodzi to prawdopodobie\u0144stwo, \u017ce gRNA naprowadzi Cas9 na inny ni\u017c zak\u0142adany przez badacza odcinek.
\n3. Cas9 jest wybredny. Naprowadzony przez gRNA na fragment DNA b\u0119dzie go ci\u0105\u0142 wy\u0142\u0105cznie wtedy, gdy jest on poprzedzony sekwencj\u0105 NGG (N – oznacza tu dowoln\u0105 zasad\u0119, a G – guanin\u0119). To znacznie ogranicza mo\u017cliwo\u015bci edytowania tego co, badacz sobie za\u017cyczy.<\/p>\n

No i tu w\u0142a\u015bnie w tej historii pojawia si\u0119 tytu\u0142owe NgAgo, czyli bia\u0142ko nale\u017c\u0105ce do rodziny Argonaute wyizolowane z archebakterii Natronobacterium gregoryi<\/em> przez chi\u0144skich naukowc\u00f3w pod przewodnictwem Dr. Chunyu Han. W opublikowanej na \u0142amach „Nature Biotechnology” pracy<\/a> dowodzili oni, \u017ce bia\u0142ko to mo\u017ce przeprowadza\u0107 obustronne przeci\u0119cia na docelowej nici DNA.<\/p>\n

W przeciwie\u0144stwie do Cas9 NgAgo nakierowywane jest przez kr\u00f3tkie, jednoniciowe DNA, czyli cz\u0105steczk\u0119 bardziej stabiln\u0105 ni\u017c gRNA. Ale to jeszcze nic. NgAgo nie mia\u0142 wymaga\u0107 istnienia \u017cadnych sekwencji poprzedzaj\u0105cych te, za kt\u00f3rych ci\u0119cie mia\u0142 si\u0119 zaraz zabra\u0107. Co wi\u0119cej, m\u00f3g\u0142 edytowa\u0107 odrobin\u0119 d\u0142u\u017csze odcinki DNA (24 nukleotydy) i wymaga\u0142 100 proc. komplementarno\u015bci, co zmniejsza\u0142o ryzyko, \u017ce system zab\u0142\u0105dzi i usunie nie to, co by\u015bmy chcieli. Poza tym NgAgo by\u0142 znacznie mniejszy od Cas9 i w og\u00f3le prostszy w zaprojektowaniu.<\/p>\n

Publikacja Hana i wsp\u00f3\u0142pracownik\u00f3w by\u0142a najbardziej medialn\u0105 chi\u0144sk\u0105 prac\u0105 naukow\u0105 roku 2016 r. Doczeka\u0142a si\u0119 ponad 4 tys. wzmianek w chi\u0144skich mediach w przeci\u0105gu jedynie dw\u00f3ch pierwszych miesi\u0119cy od ukazania si\u0119. Na prze\u0142omie marca i kwietnia 2017 r. artyku\u0142 liczy\u0142 sobie ju\u017c wystarczaj\u0105co odniesie\u0144, by baza Web of Science zaliczy\u0142a go do grona najbardziej cytowanych publikacji dla swojej dziedziny w ostatnim roku. W\u0105tpi\u0119 jednak, by chi\u0144scy badacze skakali wtenczas z rado\u015bci…<\/p>\n

Po lekturze artyku\u0142u ponad 400 badaczy niemal natychmiast wyrazi\u0142o ch\u0119\u0107 pracy z NgAgo. W kuluarach i na konferencjach naukowych m\u00f3wi\u0142o si\u0119 jednak coraz cz\u0119\u015bciej o problemach w powt\u00f3rzeniu rezultat\u00f3w uzyskanych dla NgAgo. Australijski genetyk Gaetan Burgio opisa\u0142 na swoim blogu<\/a> do\u015bwiadczenia, sugeruj\u0105c, \u017ce enzym ten w og\u00f3le mo\u017ce nie mie\u0107 zdolno\u015bci ci\u0119cia DNA. Inny badacz, Lluis Montoliu, ostrzeg\u0142<\/a> kole\u017ce\u0144stwo z hiszpa\u0144skiego Narodowego Centrum Biotechnologii w Madrycie, \u017ce kontynuowanie prac nad NgAgo to jedynie strata czasu i energii. Wed\u0142ug ankiety<\/a> przeprowadzonej w\u015br\u00f3d 165 badaczy pos\u0142uguj\u0105cych si\u0119 NgAgo ponad 60 proc. by\u0142a ze stosowania tej techniki niezadowolona, a tylko jeden naukowiec potwierdzi\u0142 przeprowadzenie modyfikacji genu w oparciu o ni\u0105.<\/p>\n

Wraz z biegiem czasu w czasopismach naukowych zacz\u0119\u0142y pojawia\u0107 si\u0119 opisy<\/a> bada\u0144<\/a>, kt\u00f3re r\u00f3wna\u0142y NgAgo z ziemi\u0105. Redakcja „Nature Biotechnology” nie pozostawa\u0142a w tej ca\u0142ej historii bierna. Nawi\u0105za\u0142a kontakt z trzema niezale\u017cnymi grupami staraj\u0105cymi si\u0119 powt\u00f3rzy\u0107 pierwotne wyniki bada\u0144, czego owocem by\u0142a wsp\u00f3lna publikacja<\/a> na \u0142amach czasopisma w listopadzie 2016 r. Jej tytu\u0142 m\u00f3wi\u0142 sam za siebie: „Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”<\/em>.<\/p>\n

Wpierw redaktorzy „Nature Biotechnology” zdecydowali si\u0119 opatrzy\u0107 publikacj\u0119 dr. Hana specjalnym redakcyjnym ostrze\u017ceniem<\/a>. Poprosili r\u00f3wnie\u017c autor\u00f3w, by ci odpowiedzieli, dlaczego \u015brodowisko naukowe ma problem z powt\u00f3rzeniem ich wynik\u00f3w. W odpowiedzi chi\u0144scy badacze przes\u0142ali do czasopisma nowe dane, z kt\u00f3rych wst\u0119pnie wynika\u0142o, \u017ce uda\u0142o im si\u0119 powt\u00f3rzy\u0107 pierwotne obserwacje z NgAgo. W tym samym czasie podobnie pilota\u017cowe informacje przekazali inni, niezale\u017cni badacze. Redakcja uzna\u0142a je wszystkie za zbyt wst\u0119pne, by mog\u0142y zosta\u0107 opublikowane.<\/p>\n

I dobrze, bo po ponad roku od publikacji nikomu nie uda\u0142o si\u0119 ostatecznie udowodni\u0107, \u017ce NgAgo faktycznie dzia\u0142a w opisany pierwotnie spos\u00f3b. W obliczu przyt\u0142aczaj\u0105cej liczby wynik\u00f3w sprzecznych z tymi zaprezentowanymi w maju 2016 r. redakcja „Nature Biotechnology” w porozumieniu z autorami wycofa\u0142a artyku\u0142<\/a>. Prawdopodobnie sprawa ta nie b\u0119dzie generowa\u0107 ju\u017c kolejnych strat czasu, energii i pieni\u0119dzy.<\/p>\n

W przypadku NgAgo w weryfikacj\u0119 pierwotnych wynik\u00f3w zaanga\u017cowa\u0142a si\u0119 spora liczba zespo\u0142\u00f3w, co nie dziwi z racji mo\u017cliwo\u015bci, jakie daje jeszcze bardziej precyzyjne redagowanie genomu. Czasopismo w mi\u0119dzyczasie podejmowa\u0142o kroki kontrolne, po\u015brednicz\u0105c w procesie weryfikacji danych, ostrzegaj\u0105c swoich czytelnik\u00f3w i wreszcie decyduj\u0105c si\u0119 na wycofanie pracy nie pod wp\u0142ywem chwili, ale po otrzymaniu dobrze ugruntowanych i licznych dowod\u00f3w na problemy z powt\u00f3rzeniem bada\u0144.<\/p>\n

Powy\u017csza historia z \u0142atwo\u015bci\u0105 mog\u0142aby rozpali\u0107 rozmaitych adwersarzy nauki jako takiej. W gruncie rzeczy podkre\u015bla jednak sprawno\u015b\u0107 procesu naukowego we wsp\u00f3\u0142czesnym \u015bwiecie. Ocena pracy badawczej nie ko\u0144czy si\u0119 bowiem w momencie przyj\u0119cia jej opisu do publikacji.<\/p>\n

Game over NgAgo? \u015awiat\u0142o dzienne ujrza\u0142a w\u0142a\u015bnie publikacja<\/a>, w kt\u00f3rej autorzy udowadniaj\u0105, \u017ce przy pomocy tej techniki mo\u017cna skutecznie zahamowa\u0107 replikacj\u0119 wirusa zapalenia w\u0105troby typu B. I wcale nie poprzez edycj\u0119 genomu, ale na na skutek rozk\u0142adu pregenomowego RNA wirusa.<\/p>\n

NgAgo zostaje wi\u0119c w grze…<\/p>\n

Cdn.<\/p>\n

Piotr Rzymski<\/strong><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Czytaj\u0105c numer „Nature Biotechnology” z maja 2016 roku, mo\u017cna by\u0142o dosta\u0107 niema\u0142ych wypiek\u00f3w na wie\u015b\u0107 o rewolucji w edytowaniu genomu, bij\u0105cej na g\u0142ow\u0119 s\u0142ynny ju\u017c CRISPR\/Cas9. Od tego czasu wiele si\u0119 zdarzy\u0142o…<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[191,1],"tags":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/5663"}],"collection":[{"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=5663"}],"version-history":[{"count":32,"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/5663\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":5711,"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/5663\/revisions\/5711"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=5663"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=5663"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/blog.polityka.pl\/naukowy\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=5663"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}